Chemical disruption of Tumor Necrosis Factor transport
Perturbation chimique du transport de Tumor Necrosis Factor
Résumé
While it is essential to fight against pathogens, TNF (Tumor Necrosis factor) secreted in excess becomes harmful to the body as in the case of chronic inflammatory diseases (rheumatoid arthritis or Crohn's disease). Current therapies are based on recurrent injections of anti-TNF against which 30% of patients develop resistance. There is therefore a strong need for chemical compounds which reduce the secretion of TNF. We have exploited the diversity of secretory pathways dependent on the Golgi apparatus to identify molecules that specifically inhibit TNF secretion. The RUSH (Retention Using Selective Hooks) tool allowed the synchronization and analysis of TNF transport in HeLa cells. By combining the RUSH assay with a differential hight content screening of chemical libraries, 85 molecules inhibiting TNF transport were selected. The effects of certain molecules have been validated. Only molecules inhibiting at least 40% of TNF secretion were retained. The specificity of these molecules on the transport of other proteins, namely EGFP-GPI and IL-6 was evaluated. The 14 molecules rather specifically inhibiting the secretion of TNF were selected to continue their characterization in a physiological model.The effects of the molecules on the endogenous secretion of TNF and other cytokines were measured in human primary monocytes and macrophages obtained from blood donors after incubation with bacterial lipopolysaccharide (LPS). These experiments in physiological models have demonstrated three molecules capable of significantly inhibiting the endogenous secretion of TNF without affecting the secretion of IL-8. Dose-response experiments and the evaluation of the effects of molecules on the expression of TNF have been carried out to help in understanding the mode of action of these molecules.In conclusion, the chemical screening, the experiments in heterologous model then in physiological models made it possible to identify 3 molecules inhibiting the secretion of TNF. These results confirm that the diversity of secretory pathways is large enough to target the transport of a protein involved in a disease and could open the way to alternative or complementary treatments against inflammatory diseases.
Alors qu'il est essentiel pour lutter contre les agents pathogènes, TNF (Tumor Necrosis factor) secrété́ en excès devient nocif pour l'organisme comme dans le cas de maladies inflammatoires chroniques (polyarthrite rhumatoïde ou maladie de Crohn). Les thérapies actuelles sont basées sur des injections récurrentes d'anti-TNF contre lesquelles 30% des patients développent une résistance. Il existe donc un fort besoin de composés chimiques réduisant la sécrétion de TNF. Nous avons exploité la diversité́ des voies de sécrétion dépendantes de l’appareil de Golgi pour identifier des molécules inhibant spécifiquement la sécrétion de TNF. L’outil RUSH (Retention Using Selective Hooks) a permis la synchronisation et l’analyse du transport de TNF dans les cellules HeLa. En combinant le test RUSH à un criblage phénotypique différentiel de banques chimiques, 85 molécules inhibant le transport de TNF ont été sélectionnées. Les effets de certaines molécules ont été validés. Seules les molécules inhibantes au moins 40% de la sécrétion de TNF ont été retenues. La spécificité de ces molécules sur le transport d’autres protéines, à savoir EGFP-GPI et IL-6 a été évaluée. Les 14 molécules inhibantes plutôt spécifiquement la sécrétion de TNF ont été retenues pour poursuivre leur caractérisation en modèle physiologique.Les effets des molécules sur la sécrétion endogène de TNF et d’autres cytokines ont été mesurés dans des monocytes et des macrophages primaires humains issus du sang de donneurs après incubation avec du lipopolysaccharide (LPS) bactérien. Ces expériences en modèles physiologiques ont mis en évidence trois molécules capables d'inhiber significativement la sécrétion endogène de TNF sans affecter la sécrétion d'IL-8. Des expériences de dose-réponse et l’évaluation des effets des molécules sur l’expression de TNF ont été réalisées pour aider dans la compréhension du mode d’action de ces molécules.En conclusion, le criblage chimique, les expériences en modèle hétérologue puis en modèles physiologiques ont permis d'identifier 3 molécules inhibant la sécrétion de TNF. Ces résultats confirment que la diversité́ des voies sécrétoires est suffisamment grande pour cibler le transport d'une protéine impliquée dans une maladie et pourraient ouvrir la voie à des traitements alternatifs ou complémentaires contre les maladies inflammatoires.
Origine : Version validée par le jury (STAR)